Iniciación a la bromatología (prácticas)	Protocolos de análisis	Ref: 19.1
CAROTENOS Y XANTOFILAS EN EL PIMENTÓN		pdf

OBJETIVO Y FUNDAMENTOS

Los colorantes naturales vegetales carotenos y xantofilas presentan una retención selectiva sobre alúmina.
La concentración de carotenos o xantofilas de cada fracción separada se determinan espectrofotométricamente.

MATERIAL

Balanza analítica.
Columna cromatográfica con sistema de vacío, según esquema adjunto, de unos 2 cm de F.
Embudo cónico.
Embudo pequeño para sólidos.
Frasco lavador.
Matraz aforado de 100 ml.
Matraces aforados de 50 ml (2)
Pesasubstancies.
Pipeta aforada de 1 ml.
Pipeta aforada de 2 ml.
Pipetas aforadas de 25 ml.
Pipetas aforadas de 5 ml.
Pipetas graduadas de 5 i 10 ml.
Probetas de 100 y 50 ml.
Espectrofotómetro.
Cubetas para lectura espectrofotométrica

REACTIVOS

Agua destilada.
Alúmina para cromatografía en columna, actividad media.
Disolución de Na2SO4 al 10 % (disolver 50 gramos de sulfato de sodio pa hasta 500 ml en agua)
Disolució patrón de Sudán I [disolver 0'1241 gramos de Sudan I pa en 500 ml de acetona-isopropanol (1/1) pa].
Disolvente HAET (hexano, acetona, etanol y i tolueno, todos de calidad pa, en las proporciones 10/7/6/7).
Hexano pa.
Hexano-acetona 90/10 (calidad pa en las proporciones indicadas).
Hexano-acetona 96/4 (calidad pa en las proporciones indicadas).
Hexano-acetona-metanol 80/10/10 (calidad pa en las proporciones indicadas).
KOH al 40 %, disolución metanólica (disolver 47'1 gramos de hidróxido de potasio pa del 85% en alcohol metílico hasta 100 ml y filtrar con placa porosa si se presentara residuo insoluble).
Na2SO4 anhidro pa.

METODOLOGÍA

1.- Pesar exactamente alrededor de 0'5 gramos de harina de pimentón y pasar a un matraz aforado de 100 ml.
2.- Pipetear 30 ml de disolvente HAET en matraz aforado; tapar y agitar 1 minuto.
3.- Añadir 1 ml de agua, tapar, agitar 1 minuto y dejar reposar 16 horas en la oscuridad.
4.- Añadir 2 ml de disolución metanólica de KOH al 40 %, agitar 1 minuto y dejar reposar 1 hora en la oscuridad.
5.- Añadir, con pipeta, 30 ml de hexano, agitar 1 minuto y añadir disolución de Na2SO4 al 10 % hasta llenar parte del cuello del matraz (no es preciso enrasar exactamente); tapar y agitar con energía durante 2 minutos.
6.- Dejar reposar 1 hora en las oscuridad.
7.- Preparar una columna cromatográfica al vacío según el esquema. Llenarla asta 10-12 cm con alúmina, adicionando la alúmina en capas pequeñas y presionando con suavidad; pone encima una capa de 1 cm de sulfato de sodio anhidro.
8.- Poner 5 ml de la capa superior (zona del cuello) del matraz en la columna; hacer vacío muy suave hasta que los 5 ml añadidos queden absorbidos en la parte superior de la columna.
9.- Pasar per la columna hexano-acetona(96/4), hasta que comience a salir líquido por la parte inferior de la columna.
10.- Pasar hexano-acetona(90/10) hasta eluir la banda de carotenos, recogiendo el líquido en un matraz aforado de 50 ml; llevar a volumen con hexano-acetona(90/10) y homogeneizar.
11.- Pasar hexano-acetona-metanol (80/10/10) hasta elución de la banda de les xantofilas, recogiendo el líquido en un matraz aforado de 50 ml; llevar a volumen con el mismo disolvente y homogeneizar.
12.- Leer en espectrofotómetro la absorbancia de la disolución de carotenos a 435 nm y la de la disolución de xantofilas a 475 nm, frente a un blanco de los disolventes empleados en cada caso.

Determinación de los factores de corrección del espectrofotómetro
1.- Recalibrar el espectrofotómetro de manera que entre 470 y 480 nm, la absorbancia de la disolución patrón de sudan I (acabada de preparar), tenga el máximo de absorbancia a 475 nm.
2.- Determinar la absorbancia de la disolución extemporánea de patrón de sudan I, a 435 nm y a 475 nm y calcular los factores de corrección.

CÁLCULOS

El resultado se expresa en miligramos/kg (ppm):

expresiones en las cuales:
A435 = Absorbancia a 435 nm.
A474 = Absorbancia a 475 nm.
Vf = Volumen final de la porción eluida.
Vd = Volumen de la porción que se pasa por columna.
F435 = Factor de corrección espectrofotométrico a 435 nm.
F475 = Factor de corrección espectrofotométrico a 475 nm.
m = peso de la muestra en gramos.

Los valores de los factores de corrección son:

en donde los Ao son las absorbancias de la disolución patrón de sudan I.

OBSERVACIONES

El método es aplicable, cambiando la cantidad a pesar y los volúmenes de elución y de enrase de los eluidos, parra alfalfa deshidratada, maíz, curry y piensos de contenido graso moderado.

Cuestionario 19.1.- Carotenos y xantofilas en pimentón

1.- Deducir razonadamente las fórmulas utilizadas en los cálculos (considerando que la actividad óptica del sudan I en las condiciones mencionadas equivale a la de 255 mg de carotenos y 212 mg de xantofilas, considerando las eluciones hasta el punto 9).

2.- Que objeto tiene la adición de KOH (subapartado 4 de la metodología)?

3.- Por que motivo se deja reposar la muestra en la oscuridad en los puntos 3, 4 y 6 de la metodología?

4.- Hacer el esquema gráfico del procedimiento analítico.

5.- Confeccionar el correspondiente "boletín de análisis".