Coneixements previs

Saccharomyces cerevisiae

El llevat de la cervesa és una cèl·lula eucariotica senzilla

Els investigadors estan interessats en els eucariotes perquè nosaltres, els humans, ho som. Les cèl·lules humanes, però, són força complicades i resulta força difícil treballar amb elles; si volem comprendre els elements fonamentals de la biologia cel·lular dels eucariotes, sovint és més eficient concentrar-se en altres espècies que, com E. Coli entre les bactèries, són senzilles, robustes i es reprodueixen ràpidament. L’espècie escollida de forma generalitzada per aquest paper de model mínim eucariota ha estat el llevat Saccharomyces cerevisiae(Fotografia 1) - el microorganisme utilitzat per a la fabricació de cervesa, de vi i de pa-.

Beatriu Escudero

Fotografia 1.- Saccharomyces cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae és un petit fong unicel·lular. De la mateixa manera que altres fongs, disposa d’una paret cel·lular relativament rígida, és relativament immòbil, i té mitocondris però no cloroplasts.

Quan l’aliment és abundant, es reprodueix gairebé tan ràpidament com un bacteri. El seu nucli tan sols conté una quantitat d’ADN unes 2’5 vegades major que la de E. Coli, per la qual cosa aquest llevat també és un bon subjecte per als anàlisis genètics. Els estudis bioquímics i genètics en llevats han estat crucials per a la comprensió de molts dels mecanismes bàsics de les cèl·lules eucariotes, incloent-hi el cicle de divisió cèl·lula (Veure Annex I).

El perquè de la seva importància biològica i científica

El llevat Saccharomyces cerevisiae (Fotografia 2) ha estat utilitzat com a un sistema model per l´estudi d´altres eucariotes superiors. Aquest microorganisme ha permès molts descobriments en la investigació de la transcripció, traducció, cicle cel.lular, transport de membrana,...

Sovint ha estat triat degut a què:

Beatriu Escudero

Fotografia 2.- Saccharomyces cerevisiae observat

al microscopi òptic reproduint-se asexualment (gemmació)

Per a conèixer millor a aquest llevat ha estat necessari:

             # Les “a” que quan s´aparellin donaran “Mat a”.

             # Les “α” que quan s´aparellin donaran “Mat α”.

Les soques “a” i “alfa” poden aparellar-se donant lloc a una soca diploide: “Mat a /α”.

“Mat a /α” és estable sota moltes condicions i quan exposem aquesta soca sota unes altres condicions (concretament un medi pobre, en una placa de Petri amb medi d’esporul·lació) aquesta cèl·lula pot entrar en meiosi i donar quatre progenitors haploides.

Aplicacions

Quan es va proposar seqüenciar el genoma de Saccharomyces cerevisiae sencer,  molts investigadors es van qüestionar la factibilitat i el valor del projecte. Pocs anys després, la seqüenciació es va completar i actualment hi ha clares evidències per demostrar que el projecte genoma era inapreciable degut a què ha tingut moltíssimes aplicacions. Algunes de les quals són:

• Identificar gens homòlegs funcionals, és a dir, gens de llevats relacionats amb gens d'altres organismes.

S'ha vist que els gens homòlegs entre llevats i humans codifiquen per proteïnes involucrades en les principals vies metabòliques i els gens que no tenen homologia codifiquen per: receptors, components de la sang, components del sistema inmunitari i per gens que no tenen similitud amb cap gen de funció coneguda.   

A l'hora d'interpretar aquests anàlisis comparatius s'ha de tenir en compte que les seqüències homòlogues no sempre indiquen conservació funcional. La conservació funcional ve indicada per la homologia de la seqüència però no es pot donar per suposat sense estudis addicionals. Una aproximació que sovint es fa per determinar si es tracta d'un gen conservat o no, és establir que la falta de funció d'un gen mutat en un llevat pugui ser complementada per un gen homòleg d'un altre organisme. Per tant, per fer estudis de conservació funcional entre llevats i humans necessitem tenir una col·lecció complerta de mutants delecionats de llevats i posseir la seqüència  complerta de cDNA per a cada gen humà.

La filogènia de famílies de gens ens pot ajudar a conèixer les funcions ancestrals i les arrels del metabolisme originari. Així, fent anàlisis comparatius es pot deduir quins són els gens mínims requerits per a què una cèl·lula funcioni, així com la reconstrucció d'una cèl·lula mínima possiblement igual a la que va originar la vida.

La seqüenciació d'entitats de cromosomes permet també explorar la cursa de l'evolució predient la força i les limitacions del genoma i comprendre el poder dels microorganismes patògens per a fer laguerra.

• Predir xarxes de regulació:

• Saber com influeix la organització gènica en el fenotip:

El genoma no és una estructura estàtica ni físicament ni temporalment ni geneticament. És per això que l'anàlisi de la seqüència genòmica ens pot ajudar a identificar com actua la restricció sobre el genoma i quin grau de fluïdesa és normal o tolerable.

• Aplicacions de Saccharomyces cerevisiae en el descobriment de drogues (fàrmacs):

L'objectiu és identificar un agent que sigui actiu en un ampli espectre de fongs patògens a través d'un mecanisme fungicida. La molècula diana a la que vagi dirigit a aquest agent ha d'estar present en l'espectre de gens patògens però no en humans. A més, també ha de codificar per a una funció essencial per a la viabilitat de la cèl·lula.

Probablement, moltes de les funcions essencials pel creixement de S.cerevisiae també ho serà pel creixement d'altres espècies de fongs. Per tant, s'haurà de fer anàlisis comparatius genòmics per tal d'identificar gens essencials en aquest llevat que siguin conservats en altres espècies de fongs i absents en humans (gens heteròlegs).

L'habilitat per expressar seqüències heteròlogues codificades en aquests organismes ens proporcionar el poder desenvolupar de forma ràpida i efectiva screenings per a nous agents terapèutics. Per això fa falta que les seqüències heteròlogues estiguin associades a un fenotip que es pugui mesurar fàcilment.

Plasmidis

L’ADN més utilitzat als experiments de transformació és una petita molècula circular anomenada plasmidi. Aquests ADN circulars, els plasmidis del Saccharomyces cerevisiae, són vectors "shuttle" que poden introduir-se amb facilitat tant en Escherichia coli com en aquest llevat. És per això que aquests plàsmids porten orígens de replicació i marcadors selectius per a mantenir-se a dita bactèria i al llevat.

Gràcies a què aquests plàsmids poden introduir-se amb facilitat dins d´aquests microorganismes, alguns gens que corresponen a un fenotip mutant poden ser aïllats per complementació amb una genoteca de plasmidis. A més, utilitzant-los per ells mateixos o amb combinació amb un promotor induïble podem sobreexpressar gens homòlegs i heteròlegs. La integració del DNA plasmídic transformat dins del genoma es fa per recombinació homòloga.

Es va acabar de seqüenciar a l´Abril del 1996. Aquest fet va ser important per dues raons:

El seu genoma té 16 cromosomes (figura 1) que tenen un rang de llargada de 200 a 2200 quilobases (Kb) i la seva seqüència genòmica total dipositada a les bases de dades és de 12,1 Megabases (Mb). Aparentment el seu genoma és ric en informació:

Quan la seqüència va ser publicada, sol s'havia descobert el 30% de la seqüència codificadora per tècniques convencionals. Per al restant 70% hi havia alguna infomació funcional que podia ser deduïda per la homologia amb altres gens de funció coneguda. No obstant, un terç de gens ni tenien una seqüència homòloga amb els gens de les bases de dades ni amb altres ORFs hipotètics o no caracteritzats.

Figura 1.- Cromosomes de Saccharomyces cerevisiae

També és possible que la majoria dels nous gens siguin requerits per a un creixement sota condicions no encara reproduïbles al laboratori.

El genoma de Saccharomyces cerevisiae té un elevat nivell de seqüències redundants. L'anàlisi d'aquesta seqüència indica que:

- D'aquests, 376 parells de gens resideixen en unes regions del cromosoma anomenades CHR (Cluster homology regions: agrupacions de regions homòlogues). Aquestes regions tenen 3 o més gens homòlegs en el mateix ordre i orientació relativa. La llargada d'aquests CHRs varia de 7.5 a 170 Kb i ocupa aproximadament el 50% del genoma. La majoria d'aquests CHRs han guanyat o perdut components com gens, introns, elements transponibles o pseudogens.

S'ha proposat que els CHRs van ser generats simultàniament en un genoma d'àmplia duplicació fa 100 milions d'anys aproximadament.

A més de tot això, també hi ha un gran número de parells de gens homòlegs localitzats fora dels CHRs, així com un número més petit de famílies de gens.

Solament els 2'5% de gens essencials s'han trobat en els CHRs. Es creu que els homòlegs d'aquests gens essencials són o no funcionals o han evolucionat cap a una funció diferent.

Un dels primers passos per a entendre la funció d'un gen és obtenir informació sobre aquest gen, és a dir, per a cada gen es necessita caracteritzar:

- La seva expressió genòmica.

- L'expressió i la modificació de les proteïnes.

- Les interaccions proteïna-proteïna.

- Les conseqüències de la cèl·lula al perdre aquest gen.

A diferència de les seqüències genòmiques, aquestes dades són dinàmiques i canvien en resposta als factors interns i externs, a les condicions del medi i a la presència de mutants.

A partir tant de cèl·lules eucariòtiques com procariòtiques es poden obtenir poblacions genèticament homogenies. Per exemple, a partir d’una sola cèl·lula vegetativa (cèl·lula en creixement) o d’una sola espora, es poden obtenir cultius de llevats i floridures. Els temes d’investigació especialment ben estudiats amb aquests organismes han estat els mecanismes de control cel·lular de la síntesi d’ADN, l’estructura del cromosoma i la reordenació i replicació dels cromosomes.

Molts espècies de llevats, entre elles el Saccharomyces cerevisiae (o llevat de panificació), creixen a la natura amb forma de cèl·lules diploides individuals. Cada cèl·lula té, segons la espècie, de 12 a 18 cromosomes.

Les cèl·lules del Saccharomyces cerevisiae es reprodueixen asexualment mitjançant la gemmació. La gemma comença a formar-se com una petita protuberància en una regió eixamplada de la paret cel·lular anomenada “placa”. La gemma va augmentant gradualment de tamany i finalment es separa de la cèl·lula parental. La divisió del nucli en els llevats no és tan complexa com a la majoria de les cèl·lules eucariòtiques; no es realitza una mitosi vertadera. Els cromosomes estan units a una estructura anomenada “cos polar del fus” -SPB de l’anglès spindle pole body- . Quan es repliquen els cromosomes, el cos polar del fus també ho fa i l’estructura del fus separa els dos SPB, de manera que un d’ells pot colocar-se a la gemma. El material cromosòmic duplicat que està al nucli parental es reparteix així entre les dues cèl·lules.

Beatriu Escudero

Fotografia 3.-Divisió cèl·lular a Saccharomyces cerevisiae

Quan una cèl·lula diploide troba condicions adverses (com manca d’aliment), experimenta una forma de diferenciació per a transformar-se en espora. Per a ser precisos, la cèl·lula diploide inicialment experimenta divisions meiòtiques (veure l’Annex I) produint quatre espores haploides. Si les condicions adverses desapareixen, les espores es fusionen formant dues cèl·lules diploides; en cas contrari, cada espora pot donar lloc a una colònia haploide (Figura 3).

Figura 2.- Cicle biologic de Saccharomyces cerevisiae

Les dues porcions haploides de cada cèl·lula diploide es diferencien en el tipus d’aparellament , degut a que l’aparellament pot dur-se a terme solament entre components haploides que poseeixen un tipus d’aparellament diferent. En condicions de creixement favorables, les cèl·lules diploides es reprodueixen asexualment per gemmació. Tanmateix, quan a una cèl·lula li manquen els nutrient essencials, sintetitza una paret exterior molt resistent, a partir de la qual es forma unaasc. A seu interior , la cèl·lula duu a terme una meiosi i els cromosomes es reparteixen independentment segons el model mendelià, donant lloc a quatre ascospores haploides. Si l’asc torna a un medi favorable,les parelles d’espores poden fusionar-se entre elles per formar cèl·lules diploides, que es desenvoluparan per gemmació com abans. D’altra banda, cada ascospora pot romandre en estat haploide donant lloc a una colonia haploide. Les cèl·lules haploides que provinguin de diferents colonies (és a dir, cèl·lules hapliodes amb diferents dotacions cromosòmiques) poden fusionar-se (o ser fusionades al laboratori) formant cèl·lules diploides.

La fusió de determinades soques de cèl·lules haploides pot produir-se gràcies a que les cèl·lules poden actuar com “tipus d’aparellament”. Solament es poden fusionar cèl·lules que difereixin en el seu tipus d’aparellament per donar lloc a cèl·lules diploides.

La expressió del tipus reproductor en llevats inclou una sofisticada xarxa de gens que interaccionen entre sí i que està governada per l’acció d’altres gens reguladors. Les cèl·lules haploides del llevat presenten els tipus reproductors “a” o “α”. Cada tipus reproductorprodueix un oligopèptid (un factor “a” o “α” respectivament) que s’uneix a les cèl·lules del tipus oposat i atura el seu creixement. Així, cada cèl·lula tendeix a agregar-se amb una cèl·lula del tipus oposat -“shmoo a” i “shmoo α” de manera que un shmoo es diferencia amb força claredat d’una cèl·lula normal del mateix llevat (Fotografia 4) i la cèl·lula diploide resultant s’anomena a/α. Els diploides a/α poden experimentar meiosi i esporulació per a produir de nou cèl·lules “a” i “α”. El tipus cel·lular d’una cèl·lula haploide està determinat per la seqüència, “a” o “α”, que es troba al locus MAT; al MAT es produeixen dos parells de ARNm diferents, un parell específic d’“a” i l’altre d’“α”. Les copies emmagatzemades d’ADN dels tipus “a” i “α” es troben en dos loci silenciosos (és a dir, que no s’expressen), HML i HMR, (llocs a l’esquerra i a la dreta, respectivament, de MAT al cromosoma III). Normalment no es transcriu cap ARN a partir de les seqüències de HML i HMR.

Beatriu Escudero

Beatriu Escudero

Fotografia 4.- Dos Shmoos (a les dues imatges superiors) i cèl·lules

en estat normal de Saccharomyces cerevisiae.

Quan s’aparellen (Figura 2) haploides genèticament diferents per donar lloc a cèl·lules diploides que, al seu torn, se’ls permet experimentar meiosi i segregació a noves espores haploides, es pot estudiar la varietat de cromosomes resultants de la primera divisió meiòtica. Aquests experiments han permès establir “grups de segregació” (grups de gens que es localitzen al mateix cromosoma). Pot detectar-se un grup de segregació per l’alta freqüència de reaparició de combinacions d’al·lels parentals a les cèl·lules de la progenie (un al·lel és una de les diverses formes homòlogues que pot adoptar un gen determinat). La localització dels gens és possible gràciesa que durant la meiosi es produeixen entrecreuaments.

S’han aïllat moltes soques mutants de cèl·lules de llevats i localitzat les seves mutacions al cromosoma. Avui en dia existeixen cents de mutants nutricionals, és a dir, cèl·lules que requereixen nutrients que una cèl·lula normal no els requeriria, així com soques que es troben bloquejades en diverses fases del seu cicle cel·lular normal.

Figura 3.-Micrografia electrònica de cossos polars del fus del llevat amb els seus microtúbuls units. La cèl·lula de llevat ha estat fixada i seleccionada, de manera que alguns dels microtúbuls no es poden veure. Tanmateix, a través de l’estudi de seccions seriades, s’ha vist que el nombre de microtúbuls és aproximadament igual al nombre de cromosomes.

El procés complet d’esporul·lació es realitza aproximadament en 24 hores, mentre que la divisió d’una cèl·lula vegetativa es completa en solament 2 hores. El procés meiòtic que forma espermatozoides i oòcits als organismes superiors té algunes semblances amb la esporul·lació dels llevats diploides. Després de la duplicació de l’ADN, cada cèl·lula premeiòtica es 4n (és a dir, té 4 copies de cada cromosoma, dues maternes i dues paternes). Aleshores la divisió meiòtica redueix els 4n a 1n als espermatozoides, oòcits i espores de llevat.

Ambdues divisions de cromosomes es produeixen, als llevats, dins d’una membrana nuclear simple. Després de completar-se la segregació dels cromosomes, la membrana nuclear original es torna a formar i envolta a cada un dels quatre nuclis haploides nous de les espores.

Al mateix temps, el material de la paret cel·lular envolta cada nucli; finalment es formen quatre espores haploides madures. La esporul·lació dels llevats presenta diversos avantatges per a la investigació enfront a la producció d’espermatozoides i oòcits en organismes multicel·lulars: en llevats poden obtenir-se mutants en els quals la meiosi es bloqueja en diversos passos; també pot induir-se la meiosi sincrònicament en gran quantitat de cèl·lules de llevat diploides.

En llevats, la iniciació provoca la formació d’espores i la meiosi. Durant la esporul·lació gran part de l’ARN i proteïnes preexistents es degraden (aproximadament el 50%) i es formen nous ARNm i proteïnes. Els nous complexes multiproteics generats abans i durant la meiosi inclouen el complex sinaptonèmic que participa en la recombinació dels cromosomes.

S’han detectat als llevats un nombrós grup de mutacions que bloquegen el cicle de divisió de les cèl·lules vegetatives. Els gens identificats per a aquestos mutants es denominen gens CDC (cicle de divisió cel·lular). La majoria d’aquests gens proporcionen les funcions necessàries a la meiosi i a la mitosi per la qual cosa són necessaris tant per al creixement cel·lular vegetatiu com per a ala esporul·lació. A més, entre 50 i 100 gens codifiquen proteïnes que són essencials per a la esporulació i per a la meiosi, però no per a la mitosi ni per al creixement cel·lular vegetatiu. Aquests gens inclouen els que codifiquen enzims que formen el material de la paret de l’espora i els que codifiquen proteases que destrueixen les proteïnes preexistents durant la formació de l’espora. Mutacions en alguns d’aquests gens interrompen la iniciació de la esporul·lació; altres bloquegen etapes discretes a la ruta de la esporul·lació.

Moltes proteïnes específiques de la esporulació encara no s’han aïllat però les anàlisis genètiques suggereixen que aquestes proteïnes es formen seqüencialment durant el procés d’esporul·lació. L’anàlisi molecular continuat de l’esporul·lació de llevats proporcionarà informació que pot ser important per a la comparació de processos comparables amb les cèl·lules superiors.